临检中心视角:新冠抗体假阳性和核酸假阴性的不可避免

锁炎
抗体“假阳性”问题

 

新型冠状病毒特异IgM和IgG抗体检测一方面被写进了国家卫生健康委发布“新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)“,作为临床确诊标准,另一方面药监局也应急审批了广州万孚、英诺特、博奥赛斯、厦门万泰凯瑞和广州和信健康五家企业的六个抗体检测试剂盒。

其中广州万孚和厦门万泰凯瑞检测的是抗新型冠状病毒总抗体,其他家检测的是IgM或IgG抗体,临床已开始广泛应用这些试剂对患者进行检测,据笔者所知,近期还会有一批抗体检测产品获批。

徐万洲等在19例核酸检测阴性但基于临床症状确诊的 COVID-19 患者中,有 16 例患者IgM 阳性,其阳性率达到 84.21%,有 18 例患者 2019-nCoV IgG 阳性,其阳性率达到 94.74%,这数据说明抗体的检测可以有效地弥补核酸检测漏检的风险

但临床现也有反映出现了较多的假阳性困扰临床决策。2019-nCoV特异IgM和IgG抗体检测出现假阳性的原因是什么?一个疑似国家卫建委临检中心小号的微信公众号发表了一些看法,本文整理如下:

首先我们来看下抗体检测的临床意义

从机体对病原体的体液免疫应答来看,病原体的特定蛋白如2019-nCoV的S蛋白和N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答,最早出现的抗体是IgM及其后的IgA抗体,然后是IgG抗体,从急性感染的一般过程,当IgG抗体出现后,浓度会持续增高,IgM则持续降低,直至消失,IgG抗体会较长时间存在。因此,特异IgM和IgG抗体是一对出现有序,此消彼长的一个关系

所以应该正确地利用及观察IgM/IgG的动态变化(如下图),有助于在病毒核酸检测这个临床诊断“金标准”失效后(因病程、标本采集等所致的假阴性)的2019-nCoV感染的诊断。

那为什么一定要是动态的,而不能是静态的检测一次呢?

这是由免疫检测的特性所决定的,也就是抗体检测会因为临床标本中的一些干扰物质的存在而出现假阳性结果。

哪些因素会导致抗体检测假阳性呢?

特异IgM和IgG免疫测定假阳性通常有以下两个方面的原因,一是试剂盒阳性判断值(Cut-off value)的设定,一些处于阳性判断值附近的弱阳性结果,很可能是假阳性;其二是患者标本中存在导致免疫测定假阳性的内源性或外源性干扰物质

阳性判断值 胶体金试纸条检测是通过肉眼观察颜色有否来判断阳性和阴性,不存在阳性判断值的问题,但会存在不同检测者判断的差异。化学发光和酶联免疫则需要设定阳性判断值,通过曲线或其他统计学方法得到的阳性判断值,不可避免处于其周边阳性一侧的结果,会有一部分弱阳性其实际为假阳性

干扰物质:干扰物质分为内源性的和外源性的,其中内源性干扰物质一般包括类风湿因子、嗜异性抗体、补体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体以及溶菌酶等。在日常的临床血清(浆)标本中,有相当比例的标本不同程度的含有上述各种干扰物质,从而可能导致测定结果的假阳性。

外源性干扰物质包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长和标本凝固不全等。血液采集后,如收集管中无促凝剂和抗凝剂,则血液通常在半小时后开始凝固,18~24h完全凝固。

日常检验中,有可能在血液还未开始凝固时即离心分离血清,此时因血液没有完全凝固,离出的“血清”并非为完全的血清,其中仍残留部分纤维蛋白原,如将其加入微孔中,在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果。

因此,血液标本采集后,应使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。综上所述,尽管从方法学设计及临床应用中,通过一些方法和措施可以大大减少IgM和IgG抗体检测的假阳性,但无法完全避免

 对于抗体的临床使用也给出了几个观点:

观点11分钟前

2019-nCoV特异的IgM和IgG抗体只能是用于在临床疑似COVID-19且病毒核酸检测阴性时,为明确诊断,可按照图1所示动态多次(2次以上)检测患者,通过动态变化来判IgM和IgG检测阳性的真假,从而避免假阳性结果对临床诊断的误导。
观点21分钟前

对于临床疑似患者,特异IgM和IgG抗体的检测也可与病毒核酸检测同时进行,当核酸检测为阴性时,抗体检测出现图1中的四种模式的任何之一,不管后续的核酸检测是否阳性,只要是真正的病毒感染者,应基本上都可以通过后续的抗体动态检测出现的结果模式明确诊断。
观点31分钟前

针对2019-nCoV刺突(S)蛋白的抗体具中和病毒的作用,采用S蛋白作为抗原的检测到的IgG抗体的出现并持续升高,应具有很好的预后及康复指示价值
观点41分钟前

将特异抗体的检测大规模用于复工或一般人群筛查的现象,是不可以的,其原因就是因为上述假阳性的出现是无法完全避免的。一般人群筛查,一旦出现阳性,会造成大量人群不需要的隔离,带来混乱。并且,抗体检测阴性,也不能排除2019-nCoV的感染。所以这种筛查的成本效益极低。

NMPA在已批准的2019-nCoV的特异抗体试剂盒说明书中的预期用途中都明确写出:仅用作对新型冠状病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用,不能作为新型冠状病毒感染的肺炎确诊和排除的依据,不适用于一般人群的筛查。

综上所述,COVID-19特异IgM/IgG抗体完全可以作为COVID-19在病毒核酸检测阴性情况下的确诊标准,其前提是需要2次以上的动态检测,以避免因标本中RF等免疫测定干扰物质的存在所致的假阳性结果的误导。正因为有这种假阳性的存在,特异IgM/IgG抗体检测不适用复工等一般人群的筛查,这是必须要强调的。

核酸“假阴性”问题

 

检测RNA病毒核酸的最为常用的方法是实时荧光RT-PCR。核酸检测试剂通过选择相似度低的区域设计探针,这样就可以特异地识别新型冠状病毒。因此试剂中的探针和相应区域的高度匹配决定了病毒核酸检测具有很好的特异性,一旦检测到,即为“阳性”,证明有病毒的存在。通常我们说病毒核酸检测是确诊感染的“金标准”,这个“金标准”就是指“阳性”结果

至于假阳性,则通常是由于实验室人员操作时,发生了标本间交叉污染或实验室扩增产物的遗留污染所致,在目前严格执行“三个阴性样本随机放在临床样本中间同时参与检测全过程”的质控策略下,可有效避免假阳性结果的报出,这也是“阳性”结果可以确诊的依据之所在。但另一方面,如果检测结果为“阴性”,则不能作为判断患者未被感染的“金标准”。

之前网络上激烈讨论的临床医生反映强烈的核酸检测“假阴性”概念,往往指的是临床症状及影像学高度疑似病毒性肺炎,但新型冠状病毒核酸检测多次或始终为“阴性”。

但对于核酸检测试剂和临床实验室而言,核酸检测“假阴性”概念则有所不同,前者指的是所采集样本中存在有足够量的病毒,但却没有被检出,而不是上述临床医生所称的核酸检测结果与临床表现不符的“假阴性”。

要想尽可能避免“假阴性”,首先要解决的是“被感染者的细胞中有一定量的病毒、采集标本时采集到含有病毒的细胞”这两个环节的问题。主要的原因如下:

(1)被感染者的细胞中有一定量的病毒:机体被病毒感染后,病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部,再到气管和支气管,进而到达肺泡,感染者会经历潜伏期、轻度症状、再到严重症状的过程,不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同,是因为这些部位细胞所含病毒受体占比不同所致。

总之,肺泡灌洗液中最容易检出病毒核酸,其次是深咳痰,再是鼻咽部,再次是口咽部。因为操作的方便性和患者的接受程度,目前临床最常用的标本是口咽部拭子,其次是鼻咽部拭子,而在某些患者中,口咽部或鼻咽部细胞中病毒量较少或极低,如果只取口咽部或鼻咽部标本检测,病毒核酸就检测不到。

因此,一个特定的疑似感染的患者,不同的病期,在不同的身体部位出现病毒的浓度会有差异,如咽部没有,却可能粪便中有,如能同时或在疾病过程中的不同时间采取上述多种标本进行检测,会有助于“假阴性”的避免。

(2)标本采集时要采集到含有病毒的细胞:采集部位不当,如采集口咽拭子时,采集深度不够;采集鼻咽拭子没有采到鼻腔深处等,可能采集到的细胞绝大部分都是不含病毒的细胞,即可能造成“假阴性”。通过加强对标本采集人员的培训,可以在很大程度上解决该问题。

(3)可靠的体外诊断试剂:体外诊断试剂的可靠性非常重要,如前所述,拟检测的病毒核酸区域的选择极为关键。探针序列的设计、试剂反应条件、反应体系、核酸加入量等都是可能影响检测分析敏感性的因素。

部分厂家的试剂产品 由于试剂厂家研发时间短,也没有使用已知临床样本进行必要的性能确认,可能存在对试剂优化不充分以及试剂批间差异大等问题。

另一方面,样本中病毒数量低于一定程度,试剂也无法检出。因此,从这个层面上看,病毒核酸检测的“假阴性”是无法完全避免的。

(4)规范的临床实验室:标本运输保存条件、临床实验室的规范操作、结果判读和质量控制等也是保证检测结果准确可靠的关键因素。通过加强对实验室人员的培训,不断完善实验室质量管理体系,可以减少因实验室检测操作层面出现的“假阴性”。

综上所述,已被感染的患者有些不能检出病毒核酸,与临床表现不符,这种“假阴性”无法完全避免,但是不是就一点别的办法都没有了呢?不是的。目前一个行之有效的办法,就是补充新型冠状病毒特异抗体检测

 

转自基因谷   作者IVD从业者

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